Hepatitis C se najlakše dijagnosticira kad su povišene vrijednosti jetrenih enzima te su anti-HCV antitijela prisutna u krvnom serumu. Dijagnoza se potvrđuje nalazom virusne nukleinske kiseline (HCV RNA) u serumu.

Akutni hepatitis C dijagnosticira se na osnovu informacije o izloženosti virusu, simptoma (najčešće žutica, umor, mučnina), poznavanjem faktora rizika kod pacijenta, značajnim povećanjem jetrenih enzima (ALT povišen deseterostruko ili više) te prisutnošću anti-HCV antitijela. Dijagnoza akutne bolesti može biti problematična jer anti-HCV antitijela nisu uvijek prisutna u vrijeme kad bolesnik razvije simptome i zatraži liječničku pomoć. Kod 30-40% oboljelih anti-HCV antitijela razvijaju se tek 2-8 sedmica nakon nastanka simptoma. U ovakvoj situaciji je potrebno testiranje prisutnosti HCV RNA jer je ovaj marker prisutan prije početka simptoma i tokom cijele akutne bolesti. Drugi je pristup ponavljanje anti-HCV testiranja mjesec  dana nakon početka simptoma.

Hronični hepatitis C se dijagnosticira kad više od šest mjeseci postoje anti-HCV antitijela i povišena je nivo jetrenih enzima. Testiranje HCV RNA pomoću PCR metode potvrđuje dijagnozu i postojanje virusa u krvi (viremija). Gotovo svim pacijentima s hroničnom HCV infekcijom dokazuje se prisutnost virusa u krvi. Dijagnoza je problematična kod osoba koje ne proizvode anti-HCV antitijela jer im je imunološki sistem potisnut ili oštećen (imunosupresija). Stoga je preporučljivo obaviti HCV RNA testiranje osobama koje su kandidati za presađivanje organa, bolesnicima na dijalizi, osobama pod terapijom kortikosteroidima, oboljelim od agamaglobulinemije ili drugih imunosupresivnih bolesti. Dijagnoza je također škakljiva kod osoba koje proizvode anti-HCV antitijela, ali imaju još neku jetrenu bolest koja može dovesti do ozljede jetre, npr. alkoholna bolest jetre, preopterećenje željezom ili autoimunu bolest. U takvim situacijama prisustvo anti-HCV može biti odraz lažno-pozitivne reakcije, prethodne HCV infekcije ili blagog hepatitisa C. Tada će HCV RNA testiranje pomoći i potvrditi stvarno postojanje infekcije virusom hepatitisa C.

Diferencijalna dijagnoza: stanja koja se mogu zamijeniti s hroničnim hepatitisom C su:

• autoimuni hepatitis
• hronični hepatitis B i D
• alkoholni hepatitis
• nealkoholni steatohepatitis
• Wilsonova bolest
• manjak alfa-1-antitripsina
• jetrena bolest uzrokovana lijekovima, otrovima i hemikalijama